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螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)介紹
螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于真核生物基因表達(dá)和細(xì)胞生理學(xué)研究，包括受體活性、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA加工和蛋白質(zhì)折疊等。螢光素酶是理想的報(bào)告基因，因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞中不含內(nèi)源性螢光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶。單螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)往往會(huì)受到各種實(shí)驗(yàn)條件的影響，而雙螢光素酶報(bào)告基因通常被用來提高實(shí)驗(yàn)精確度，即在一個(gè)系統(tǒng)中同時(shí)表達(dá)和測量兩個(gè)獨(dú)立的報(bào)告基因。一般來說，實(shí)驗(yàn)組報(bào)告基因與具體實(shí)驗(yàn)條件的影響是相關(guān)的，而共同轉(zhuǎn)染的內(nèi)對照組報(bào)告基因則是用來充當(dāng)校正參數(shù)，作為內(nèi)參提供反應(yīng)基線。將實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果與內(nèi)對照組的結(jié)果進(jìn)行約化處理，可降低由細(xì)胞存活率或轉(zhuǎn)染效率的差異而導(dǎo)致的結(jié)果波動(dòng)，同時(shí)還可消除由取樣體積、細(xì)胞裂解效率和儀器測定引起的實(shí)驗(yàn)誤差。因此，雙報(bào)告基因檢測可以通過減少外部影響來獲得更可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
美侖雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（Meilunbio?Firefly&Renilla Luciferase Reporter Assay Kit）提供了一種有效的雙報(bào)告基因檢測方法，在同一個(gè)樣品中先以螢光素（Luciferin）為底物來檢測螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase），后以腔腸素（Coelenterazine）為底物來檢測海腎螢光素酶（Renilla luciferase），同時(shí)淬滅Firefly luciferase的螢光信號，實(shí)現(xiàn)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測。
報(bào)告基因技術(shù)服務(wù)平臺優(yōu)勢：
1. 擁有成熟的報(bào)告基因檢測平臺，具有獨(dú)立研發(fā)的報(bào)告基因相關(guān)產(chǎn)品。
2. 擁有成熟的項(xiàng)目執(zhí)行團(tuán)隊(duì)，收到客戶需求后能當(dāng)天出具實(shí)驗(yàn)方案，及時(shí)為您反饋項(xiàng)目進(jìn)展。
3. 高效的轉(zhuǎn)染試劑，確保結(jié)果穩(wěn)定和可重復(fù)性
4. 詳細(xì)的原始數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，確保結(jié)論清晰可靠
5.服務(wù)周期短，執(zhí)行能力強(qiáng)，一切從客戶方出發(fā)，為您提供最滿意的實(shí)驗(yàn)服務(wù)體驗(yàn)！
本公司現(xiàn)提供雙螢光素酶報(bào)告基因檢測技術(shù)服務(wù)具體內(nèi)容如下：
一. 啟動(dòng)子活性研究
順式作用元件(cis-acting element)存在于基因旁側(cè)序列中能影響基因表達(dá)的序列。順式作用元件包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等，它們的作用是參與基因表達(dá)的調(diào)控。而轉(zhuǎn)錄因子則是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。
檢測藥物或者轉(zhuǎn)錄因子對于靶基因啟動(dòng)子調(diào)控作用是雙酶報(bào)告基因主要功能之一。將目的基因啟動(dòng)子區(qū)連接到Firefly luciferase序列，通過給藥或者共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子后，報(bào)告基因表達(dá)的改變，來確定給藥或者轉(zhuǎn)錄因子對靶基因啟動(dòng)子調(diào)控作用。
1. 檢測藥物處理對目的啟動(dòng)子活性的影響
材料：實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒pGL4.17[luc2/Neo] (E6721 Promega)；對照質(zhì)粒；pGL4.73[hRluc/SV40] (E6911 Promega)；目的藥物；目的細(xì)胞株
步驟：
1)藥物選擇、作用啟動(dòng)子以及目的細(xì)胞株都確認(rèn)后，合成啟動(dòng)子序列；
2) 將啟動(dòng)子克隆至報(bào)告基因載體；
3) 將報(bào)告載體與內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；
4) 多功能酶標(biāo)儀檢測報(bào)告基因表達(dá)水平
5) 數(shù)據(jù)分析，整理提交客戶原始數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)報(bào)告
注：為了實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可以添加突變組或者天然組作為對照
分組參考：一組實(shí)驗(yàn)包括（啟動(dòng)子；空載；啟動(dòng)子+給藥；空載+給藥），每組檢測時(shí)各做3個(gè)復(fù)孔。
客戶需提供信息：
①目標(biāo)啟動(dòng)子信息（名稱、種屬、基因序列等）
②所需藥物名稱及濃度梯度設(shè)計(jì)
提供給客戶：
①質(zhì)粒及其構(gòu)建報(bào)告
②原始數(shù)據(jù)
③雙螢光素酶檢測報(bào)告
報(bào)價(jià)情況
美侖生物 5000/組+1750元/單個(gè)藥物濃度；
服務(wù)周期：3-4周
2.檢測轉(zhuǎn)錄因子對目的啟動(dòng)子活性的影響
材料：實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒pGL4.17[luc2/Neo] (E6721 Promega)；對照質(zhì)粒；pGL4.73[hRluc/SV40] (E6911 Promega)；轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)質(zhì)粒；293T細(xì)胞株
步驟：
1) 靶點(diǎn)預(yù)測及確認(rèn)后，直接合成啟動(dòng)子序列或者轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控區(qū)序列；
2) 將上述合成的DNA片段克隆至報(bào)告基因載體；
3) 構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)載體；
4) 將報(bào)告載體和內(nèi)參質(zhì)粒以及轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；
5) 多功能酶標(biāo)儀檢測報(bào)告基因表達(dá)水平
6) 數(shù)據(jù)分析，整理提交客戶原始數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)報(bào)告
注：為了實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可以添加突變組或者天然組作為對照。
分組參考：具體分組如下表，每組檢測時(shí)各做3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒構(gòu)建需視難易程度另行收費(fèi)。
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組別 |
啟動(dòng)子 |
轉(zhuǎn)錄因子 |
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1 |
啟動(dòng)子空載+內(nèi)參質(zhì)粒 |
pcDNA3.1空載 |
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2 |
啟動(dòng)子空載+內(nèi)參質(zhì)粒 |
轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)-pcDNA3.1 |
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3 |
啟動(dòng)子+內(nèi)參質(zhì)粒 |
pcDNA3.1空載 |
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4 |
啟動(dòng)子+內(nèi)參質(zhì)粒 |
轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)-pcDNA3.1 |
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5 |
啟動(dòng)子-mut+內(nèi)參質(zhì)粒 |
pcDNA3.1空載 |
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6 |
啟動(dòng)子-mut +內(nèi)參質(zhì)粒 |
轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)-pcDNA3.1 |
客戶需提供信息：
①目標(biāo)啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)信息（名稱、種屬、基因序列等）
提供給客戶：
①質(zhì)粒及其構(gòu)建報(bào)告
②原始數(shù)據(jù)
③雙螢光素酶檢測報(bào)告
提供給客戶：
①質(zhì)粒及其構(gòu)建報(bào)告
②原始數(shù)據(jù)
③雙螢光素酶檢測報(bào)告
報(bào)價(jià)情況
7500（含一組突變），每增加一組突變組+2500元；
服務(wù)周期：3-4周
成功案例分享：檢測轉(zhuǎn)錄因子對目的啟動(dòng)子活性的影響
從圖中的結(jié)果可以看到，該轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控目標(biāo)基因啟動(dòng)子。目標(biāo)基因啟動(dòng)子突變后，這種調(diào)控關(guān)系消失，由此證實(shí)了該轉(zhuǎn)錄因子是通過該結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控luciferase的表達(dá)。
二. miRNA靶基因驗(yàn)證 (針對3’UTR元件)
miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻譯），將目的基因3’UTR（野生型和結(jié)合位點(diǎn)突變型）序列構(gòu)建至載體中報(bào)告基因F-Luc的3’端，通過比較過表達(dá)miRNA后，報(bào)告基因表達(dá)的改變（螢光素酶的活性下降還是不變），來確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。
目的：驗(yàn)證miRNA與靶基因3’UTR 是否發(fā)生調(diào)控作用。
材料：質(zhì)粒pMIR-REPORT Luciferase基因3'UTR（Wt）；pMIR-REPORT Luciferase-基因3'UTR（Mut）；pRL-CMV（H321，Promega）；293T細(xì)胞株
步驟：
1) 靶點(diǎn)預(yù)測及確認(rèn)后，直接合成靶基因3’UTR序列或microRNA在靶基因3’UTR上的結(jié)合位點(diǎn)序列；
2) 將上述合成的DNA片段克隆至報(bào)告基因載體psiCHECK2 (C8021) or pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (E1330)；
3) 購買microRNA mimics；
4) 將報(bào)告載體與microRNA mimics共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；
5) 多功能酶標(biāo)儀檢測報(bào)告基因表達(dá)水平
6) 數(shù)據(jù)分析，整理提交客戶原始數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)報(bào)告
注：為了實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)性，可加入靶基因3’UTR區(qū)microRNA預(yù)測結(jié)合區(qū)域的突變體作為對照，進(jìn)一步說明問題。
客戶需提供信息：
①靶基因名稱
②靶基因種屬
③調(diào)控因子相關(guān)信息
提供給客戶：
①質(zhì)粒及其構(gòu)建報(bào)告
②原始數(shù)據(jù)
③雙螢光素酶檢測報(bào)告
技術(shù)路線簡圖
報(bào)價(jià)情況：5500元/組（靶點(diǎn)）
服務(wù)周期：3-4周
